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单细胞测序技术服务 靶向lncRNA单细胞全转录组测序 单细胞全转录组测序 |
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生物分子凝聚体研究 HyPro靶RNA临近标记技术 |
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NGS测序技术服务 DRIPc-seq |
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NGS测序技术服务 环状DNA测序 |
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基因芯片技术服务 Small RNA修饰芯片 m6A单碱基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表观转录组芯片 circRNA表观转录组芯片 |
NGS测序技术服务 RNA m6A甲基化测序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA碱基修饰检测 tRNA碱基修饰检测 |
PCR技术服务 MeRIP-PCR技术服务 m6A绝对定量RT-PCR技术服务 m6A单碱基位点PCR（MazF酶切法）技术服务 |
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NGS测序技术服务 DNA甲酰基胞嘧啶(5fc)修饰测序 DNA 5hmC 测序（化学法） DNA甲基化测序 DNA羟甲基化测序 染色质免疫共沉淀测序 |
PCR技术服务 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相对定量 TMT标记定量技术 非标定量技术 |
蛋白修饰 TMT标记定量磷酸化 非标定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 HyPro靶RNA临近标记技术 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
作为基因组DNA的直接产物，RNA对生命活动有着至关重要的意义，是生命活动的又一执行者：1、参与蛋白质的合成；2、参与转录后修饰和DNA修复；3、参与基因表达调控等。对于一种特定的RNA（如，lncRNA，mRNA，circRNA，microRNA，tRF&tiRNAs等），往往具有与之对应的相互作用蛋白共同执行特定的生理功能，以lncRNA为例，近年来，lncRNAs在基因表达调控方面的重要功能越来越被人们所关注，但它们的具体功能还有待阐明。LncRNA可能通过4种作用机制参与基因调控：Decoy，作为诱饵分子，替代蛋白与DNA的相互作用；Scaffold，作为骨架分子，为蛋白复合体提供空间支撑作用；Guide，作为引导分子，介导蛋白-蛋白、蛋白DNA/RNA相互识别；Enhancer，作为增强子类似组件，促进基因表达[1] 。运用RNA亲和纯化技术（eg. ChIRP-MS，RAP-MS[2]），构建特定RNA相互作用蛋白谱，对阐明RNA的生理病理机制至关重要。
图1. lncRNA作用机制模型。
参考文献
1.Rinn, J. L. & Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [PMID: 22663078].
2.McHugh, C. A. et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature 521, 232-236, doi:10.1038/nature14443 (2015). [PMID: 25915022].
根据目标RNA的尺寸大小，可采用两种相似的技术策略：
长链RNA：例如，lncRNA、circRNA、mRNA等常采用RNA Antisense Purification – Mass Spectrometry策略。生物样品在非变性条件下裂解和UV交联，或者不裂解直接在原位进行UV交联，随后用biotin标记的RNA anti-sense进行杂交（Control组采用非特异anti-sense或预先用RNase处理）。
短链RNA：例如，micoRNA、tRF&tiRNA等通常采用RNA Affinity Purification – Mass Spectrometry策略。体外合成biotin标记的目标RNA（Control组采用scramble RNA），加入到非变性裂解的生物样品中，孵育替换内源的RNA。
随后，通过固定化avidin对biotin进行pull-down，得到的RBP经LC-MS/MS鉴定和定量分析，与目标RNA特异性相互作用的蛋白（A, B, C, D）在两组间具有显著差异，非特异相互作用蛋白（X）在两组间比例接近1：1。据此构建目标RNA的相互作用蛋白谱。
图2.RAP-MS技术原理和实验流程。
案例展示1
运用ChIRP-MS技术 (和RAP-MS技术原理相同的技术，a)，Stanford大学的科研人员对Xist RNA的相互作用蛋白谱进行了研究，发现81种Xist RNA相互作用蛋白，对Xist的功能行使具有重要意义。[3]
首先，为了对ChiRP-MS方法进行验证，作者选择了两种已知的snRNA，U1/U2（参与剪接体的组装）进行验证实验。U1/U2具有很高的表达量，同时，剪接体的组分研究得较为清楚，另外，U1/U2在抑制未成熟mRNA的剪接和poly-A化方面的作用已见报道，预示着更多未知的相互作用蛋白可能被鉴定到，因此U1/U2很适用于ChIRP-MS方法验证。针对U1/U2设计anti-sense RNA进行ChIRP-MS实验，结果如下：U1和U2分别富集了418和370个蛋白，其中113个已知的剪接体蛋白（共143个）(c)。
相互作用网络图进一步展示了U1/U2互作蛋白富集情况：位于上部的为已知蛋白，主要为剪接体蛋白，位于下方的为功能未知蛋白，包括只与U1或U2互作的蛋白以及和两者共同作用的蛋白。ChIRP-MS技术不仅能够很好的鉴定已知的RNA互作蛋白，同时也能鉴定未知蛋白，是研究RNA-protein相互作用的强大工具。
案例展示2
在多种应激条件下，tRNA能够发生特异性酶切，产生一类功能独特的tRNA片段（tRFs），和许多生理病理过程密切相关。来自Rockefeller University的科学家通过高通量测序技术发现一类tRFs特异性高表达于高转移性乳腺癌细胞中，并具有特定的motif，据此推测，细胞中可能存在某些与之特异性识别的蛋白质。为了鉴定这些未知的相互作用蛋白，作者运用RNA亲和纯化技术，用biotin标记的tRFs片段进行pull down（短链RNA RAP-MS技术），结合LC-MS/MS鉴定和定量分析，发现一个潜在的结合蛋白YBX1，并进行了深入研究。结果表明，YBX1蛋白能够与肿瘤转移相关基因mRNA结合并稳定mRNA，而tRFs可与mRNA竞争性结合YBX1，进而使肿瘤转移相关的mRNA去稳定性，抑制肿瘤的转移性。[4]
