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MeRIP-Seq (m6A-seq, m1A-seq, m5C-seq, m7G-seq)

  • m6A研究背景
  • m1A研究背景
  • m5C研究背景
  • m7G研究背景
  • 服务特点
  • 实验流程
  • 结果展示

  •        m6A（N6-methyladenosine，6-甲基腺嘌呤）是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种甲基化修饰，同时可以功能性的调节真核生物的转录组从而影响mRNA的剪接、出核、定位、翻译和稳定。m6A RNA出现在多种重要的细胞生命过程中，意味着mRNA甲基化参与了多种生物学过程，如干细胞分化、生物节律等，同时也参与了多种疾病的发生，包括肿瘤、肥胖和不育等。


    m6A甲基化和去甲基化示意图 


    图1：m6A甲基化和去甲基化示意图


           目前对m6A的转录组研究方法为MeRIP-seq（mRNA甲基化测序）的方法，其原理是通过m6A特异性抗体对细胞内具有m6A修饰的RNA片段进行免疫共沉淀，将富集下来的RNA片段进行高通量测序。结合生物信息学分析，即可在转录组范围内对m6A修饰进行系统研究。

  • m1A（1-甲基腺嘌呤）是一种新发现的mRNA和 lncRNA修饰[1-3]，它可以基于Watson-Crick配对方式上的错误破坏性地影响RNA二级结构和蛋白质-RNA的相互作用[1, 2]。在酶促作用下，mRNA 上的m1A由TRM6-TRM61复合物催化，但这只占 mRNA 上发现的修饰的一小部分[1, 3]。在YTH这种m6A reader蛋白家族中，YTHDF2 被认为是细胞中潜在的 m1A reader，可介导破坏含m1A修饰的RNA稳定性[4]。另外的研究还表明，YTHDF3也可与某些m1A甲基化转录本结合，尤其是IGF1R（胰岛素样生长因子1受体），从而抑制滋养层细胞的侵袭 [5]。ALKBH3是唯一已知的 mRNA m1A 修饰eraser[6]。m1A修饰失调与许多疾病有关。例如， CSF1 (集落刺激因子1) mRNA的m1A去除促进其mRNA的稳定性，被认为可维持乳腺癌和卵巢癌的侵袭性[6]；Aurora A mRNA的ALKBH3依赖性m1A去甲基化可抑制纤毛的生成[7]；在胃肠癌中，ErbB和mTOR 通路中的ErbB2、mTOR和AKT1S1中枢基因被发现受m1A 调节 [8]。另外，m1A 还被证明在应激诱导的肉芽形成过程中具有保护作用[9]。


    m1A研究参考文献：

    1. Safra M et al: The m1A landscape on cytosolic and mitochondrial mRNA at single-base resolution. Nature 2017, 551(7679):251-255.[PMID: 29072297]
    2. Li X et al: Base-Resolution Mapping Reveals Distinct m(1)A Methylome in Nuclear- and Mitochondrial-Encoded Transcripts. Mol Cell 2017, 68(5):993-1005 e1009.[PMID: 29107537]
    3. Dominissini D et al: The dynamic N(1)-methyladenosine methylome in eukaryotic messenger RNA. Nature 2016, 530(7591):441-446.[PMID: 26863196]
    4. Seo KW, Kleiner RE: YTHDF2 Recognition of N(1)-Methyladenosine (m(1)A)-Modified RNA Is Associated with Transcript Destabilization. ACS Chem Biol 2020, 15(1):132-139.[PMID: 31815430]
    5. Zheng Q et al: Cytoplasmic m(1)A reader YTHDF3 inhibits trophoblast invasion by downregulation of m(1)A-methylated IGF1R. Cell Discov 2020, 6:12.[PMID: 32194978]
    6. Woo HH, Chambers SK: Human ALKBH3-induced m(1)A demethylation increases the CSF-1 mRNA stability in breast and ovarian cancer cells. Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech 2019, 1862(1):35-46.[PMID: 30342176]
    7. Kuang W et al: ALKBH3-dependent m(1)A demethylation of Aurora A mRNA inhibits ciliogenesis. Cell Discov 2022, 8(1):25.[PMID: 35277482]
    8. Zhao Y et al: m1A Regulated Genes Modulate PI3K/AKT/mTOR and ErbB Pathways in Gastrointestinal Cancer. Transl Oncol 2019, 12(10):1323-1333.[PMID: 31352195]
    9. Alriquet M et al: The protective role of m1A during stress-induced granulation. J Mol Cell Biol 2021, 12(11):870-880.[PMID: 32462207]

  • 虽然 m5C（5-甲基胞嘧啶） 在各种各样的非编码 RNA 中早已存在，但它在编码 RNA 中的存在直到最近才被证实[1, 2]。NSUN2 [3]和NSUN6[4, 5] 将这种修饰添加在 mRNA 上，TET2 作为eraser蛋白将m5C氧化为hm5C[6]。m5C有两种可能的reader蛋白：ALYREF能够促进甲基化 mRNA从细胞核输出，YBX1可以稳定带有m5C修饰的 mRNA [7, 8]。m5C mRNA 修饰具有多种重要的生物学功能，包括作为DNA损伤信号来调节DNA修复[9]、参与干细胞分化[2]、促进母体向合子转变[8]，以及通过促进脂肪生成控制细胞周期进程[10]。此外，也有研究表明m5C与膀胱癌的发病机制[7]和病原体感染诱导的骨髓细胞生成[6]等疾病有关。


    m5C研究参考文献：
    1. Huber SM et al: Formation and abundance of 5-hydroxymethylcytosine in RNA. Chembiochem 2015, 16(5):752-755.[PMID: 25676849]
    2. Amort T et al: Distinct 5-methylcytosine profiles in poly(A) RNA from mouse embryonic stem cells and brain. Genome Biol 2017, 18(1):1.[PMID: 28077169]
    3. Yang X et al: 5-methylcytosine promotes mRNA export - NSUN2 as the methyltransferase and ALYREF as an m(5)C reader. Cell Res 2017, 27(5):606-625.[PMID: 28418038]
    4. Liu J et al: Sequence- and structure-selective mRNA m(5)C methylation by NSUN6 in animals. Natl Sci Rev 2021, 8(6):nwaa273.[PMID: 34691665]
    5. Selmi T et al: Sequence- and structure-specific cytosine-5 mRNA methylation by NSUN6. Nucleic Acids Res 2021, 49(2):1006-1022.[PMID: 33330931]
    6. Shen Q et al: Tet2 promotes pathogen infection-induced myelopoiesis through mRNA oxidation. Nature 2018, 554(7690):123-127.[PMID: 29364877]
    7. Chen X et al: 5-methylcytosine promotes pathogenesis of bladder cancer through stabilizing mRNAs. Nat Cell Biol 2019, 21(8):978-990.[PMID: 31358969]
    8. Yang Y et al: RNA 5-Methylcytosine Facilitates the Maternal-to-Zygotic Transition by Preventing Maternal mRNA Decay. Mol Cell 2019, 75(6):1188-1202 e1111.[PMID: 31399345]
    9. Chen H et al: m(5)C modification of mRNA serves a DNA damage code to promote homologous recombination. Nat Commun 2020, 11(1):2834.[PMID: 32503981]
    10. Liu Y et al: mRNA m5C controls adipogenesis by promoting CDKN1A mRNA export and translation. RNA Biol 2021, 18(sup2):711-721.[PMID: 34570675]

  • N7-甲基鸟嘌呤(m7G)是真核生物mRNA 5'帽子上带正电荷的重要修饰[1]，有助于介导翻译、剪接和核输出过程并防止降解。除了经典底物tRNA [4-7]和18S rRNA [8]之外，m7G还在存在于mRNA [2]和miRNA [3]内部，这些m7G修饰都由异二聚体METTL1-WDR4介导添加在哺乳动物的RNA中。mRNA内部的m7G修饰可以提高翻译效率[2]，并且在H2O2和热休克处理下受到动态调节，在CDS和3' -UTR区域显著积累[9]。miRNA m7G修饰被认为可以通过破坏几种初始miRNA (pri-miRNA) 转录产物中G-四联体的抑制性二级结构来激活和促进miRNA加工过程，并参与抑制肺癌细胞迁移[3]。总之，METTL1/WDR4介导的m7G tRNA甲基化是正常mRNA翻译和胚胎干细胞自我更新和分化所必需的[4]，并促进癌症中致癌mRNA的翻译 [5-7]，并且人类18S rRNA 1639 位的m7G修饰也与晚期核rRNA前体加工和 40S 核糖体亚基的生物合成相关[10]。


    m7G研究参考文献：
    1. Ramanathan A, Robb GB, Chan SH: mRNA capping: biological functions and applications. Nucleic Acids Res 2016, 44(16):7511-7526.[PMID: 27317694]
    2. Zhang LS et al: Transcriptome-wide Mapping of Internal N(7)-Methylguanosine Methylome in Mammalian mRNA. Mol Cell 2019, 74(6):1304-1316 e1308.[PMID: 31031084]
    3. Pandolfini L et al: METTL1 Promotes let-7 MicroRNA Processing via m7G Methylation. Mol Cell 2019, 74(6):1278-1290 e1279.[PMID: 31031083]
    4. Lin S et al: Mettl1/Wdr4-Mediated m(7)G tRNA Methylome Is Required for Normal mRNA Translation and Embryonic Stem Cell Self-Renewal and Differentiation. Mol Cell 2018, 71(2):244-255 e245.[PMID: 29983320]
    5. Orellana EA et al: METTL1-mediated m(7)G modification of Arg-TCT tRNA drives oncogenic transformation. Mol Cell 2021, 81(16):3323-3338 e3314.[PMID: 34352207]
    6. Ma J et al: METTL1/WDR4-mediated m(7)G tRNA modifications and m(7)G codon usage promote mRNA translation and lung cancer progression. Mol Ther 2021, 29(12):3422-3435.[PMID: 34371184]
    7. Dai Z et al: N(7)-Methylguanosine tRNA modification enhances oncogenic mRNA translation and promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression. Mol Cell 2021, 81(16):3339-3355 e3338.[PMID: 34352206]
    8. Sloan KE et al: Tuning the ribosome: The influence of rRNA modification on eukaryotic ribosome biogenesis and function. RNA Biol 2017, 14(9):1138-1152.[PMID: 27911188]
    9. Malbec L et al: Dynamic methylome of internal mRNA N(7)-methylguanosine and its regulatory role in translation. Cell Res 2019, 29(11):927-941.[PMID: 31520064]
    10. Ounap K, Kasper L, Kurg A, Kurg R: The human WBSCR22 protein is involved in the biogenesis of the 40S ribosomal subunits in mammalian cells. PLoS One 2013, 8(9):e75686.[PMID: 24086612]

  • ●灵活度高：能够直接对任意物种的转录组高甲基化片段进行测序，无需已知的基因组序列信息。
    ●检测范围广：覆盖整个转录组范围的甲基化区域。
    ●精确度高：能够在实际结合位点100-200个碱基范围内精确定位。
    ●数字化信号：直接对甲基化片段进行定量和测序，不存在传统芯片杂交的荧光模拟信号带来的交叉反应和背景噪音问题。

  • merip seq实验流程

      图2：MeRIP-seq实验流程图 


  • 1.m6A甲基化峰分析


    m6A甲基化谱数据列表  

    表1：m6A甲基化谱数据列表


    2.m6A甲基化峰注释
           利用RefSeq数据库对peak所在位置进行注释，统计不同转录本区域出现peaks的次数。

     m6A甲基化峰分布图

    图3：m6A甲基化峰分布图


    3. m6A甲基化峰的可视化

           m6A甲基化测序结果中的wig文件能够上传到基因组浏览器中，以便进行m6A信号区域的可视化。

    m6A甲基化峰的可视化分析
    图4：可视化分析


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