研究small RNA修饰的挑战与方法-康成生物丨数谱生物

研究small RNA修饰的挑战与方法

定性及定量分析small RNA修饰是研究越来越重要的small RNA表观转录组学的关键步骤。然而，直到最近，相关的方法学与技术手段还是较为贫乏，仅具有有限的分析能力。随着以微阵列技术为基础的方法创新，高通量、高灵敏度、高准确性和具有计算修饰化学计量能力的small RNA谱分析现在可用于生物和临床研究实验室，以推进small RNA表观转录组学的新研究和相关临床应用。

分析small RNA修饰研究面临的挑战

虽然测序已被用于small RNA表达分析，但是RNA上的修饰对测序定量的影响目前其实被很大程度的忽略了。事实上，各种的RNA修饰，如m1A、m3C、m1G等，在测序文库构建过程中会干扰逆转录反应，从而对small RNA，特别是对small RNA修饰的精确定量造成很大的干扰。例如，small RNA-seq结果大多偏向于检测到18-nt的3 '-tsRNA，而不是通过northern blot观察到的更主要的22-nt亚型。这是由于在TUC环上的m1A修饰阻碍了逆转录过程的进行。由于大多数small RNA测序数据是通过上述文库构建方法获得的。因此，这些数据可能会对small RNA修饰研究造成误导。

此外，通过small RNA-seq进行的small RNA分析需要经过多个PCR扩增步骤，这会导致测序结果显著的定量偏差以及不准确性，因此需要使用独立的、正交的方法进行相关研究。

在实践中，大多数基于测序的修饰研究方法需要大量的实验材料(> 100 µg总RNA)，这使得许多只能获取有限样本量的实验无法开展。

更进一步的问题在于，small RNA-seq通常使用RPM（每百万Reads中来源于某一基因reads数）这一指标进行标准化，并以此表示样本中的相对RNA丰度。然而，RPM取决于样本中small RNA类群整体的组成情况。单个small RNA的RPM变化会改变所有其他small RNA的RPM值，即使它们实际的绝对表达水平没有改变。

综上所述，为了在高灵敏度、准确化学计量的标准下鉴定和量化修饰small RNA谱，有必要开发测序非依赖的方法以克服基于测序方法的这些局限性。

对small RNA转录后修饰的定量技术

Arraystar small RNA修饰芯片技术(图1)结合了small RNA定量芯片以及RNA免疫沉淀技术（RIP），通过对同一微阵列上带有修饰以及不带修饰的small RNA水平进行同时检测，为研究包括miRNA，pre-miRNA，tsRNAs（tRF以及tiRNA）在内的small RNA修饰的调控作用提供了重要信息。

图1. Arraystar small RNA修饰芯片鉴定和定量small RNA转录后修饰，检测的修饰包括O8G、m7G、m6A、Ψ和m5C等。其原理主要是使用特异性抗体免疫沉淀富集修饰small RNA，然后使用Arraystar small RNA修饰芯片对其进行鉴定和定量。

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